Hogyan zajlik a preimplantációs genetikai diagnosztika (PGD) során a mintavétel, milyen eszközökkel és tudományos eljárásokkal vizsgálják a petesejtet és a preembriót?
A különböző genetikai rendellenességet - számbeli vagy szerkezeti kromoszóma-rendellenességet, nemi kromoszómához kötött rendellenességet, recessziv vagy domináns monogénes betegséget - hordozó párok a gyermekvállalás során kénytelenek jelentős kockázatot vállalni. A terhesség gyakran spontán vetéléssel ér véget, illetve a megszületett gyermekek öröklött betegségével, esetleg korai halálával is számolni kell. Ez a nyilvánvaló egészségügyi kockázaton kívül szociális terhet is jelent a szülők és a társadalom számára, valamint komoly etikai kérdéseket vet fel. A prenatalis (születés előtti) genetikai vizsgálat eredményének ismeretében már csak a létrejött terhesség esetleges megszakítására van lehetőség. Ezt előzhetjük meg a preimplantációs (beágyazódás előtti) genetikai vizsgálat (PGD) elvégzésével.
Mintavétel a vizsgálathoz
Preimplantációs genetikai vizsgálat (PGD) elvégzésére a mesterséges megtermékenyítés (in vitro fertilizáció, IVF) és az embriótranszfer (ET) során nyílik lehetőség. A vizsgálat elvégzéséhez általában harmadik napon, az 5-10 sejtes preembrióból mikromanipulátor segítségével kivesznek egy vagy két sejtet (blasztomert). Ehhez a preembriót először kalcium- és magnéziummentes tápoldatba helyezik a sejtek közötti szoros kapcsolatok oldására. A mikromanipulátor tartópipettájával rögzített preembrió zona pellucidáját lézerrel, savas oldattal vagy mechanikusan megnyitják, majd biopsziás pipetta segítségével óvatosan kiemelik a blasztomert.
A petesejt első, illetve második sarki testéből (a petesejthez kapcsolódó két képlet, amely szintén tartalmazza a petesejt genetikai állományát, de nem vesz részt a megtermékenyülés utáni folyamatokban) is elvégezhető a vizsgálat. Ebben az esetben azonban értelemszerűen csak a petesejtről kapunk információt. Lehetőség nyílik továbbá a megtermékenyítést követő ötödik napon, hólyagcsíra (blasztociszta) stádiumban, az úgynevezett trophektoderm sejtek biopsziájára. Az utóbbi években az ún. vitrifikációs technikák fejlődése révén - melynek alkalmazásával a mélyhűtött blasztociszták felmelegítés utáni életképessége lényegesen jobb, mint a korábban alkalmazott mélyfagyasztási módszerekkel - az ötödik napi mintavétel kezd egyre jobban elterjedni.
A genetikai elemzés
A genetikai vizsgálat polimeráz láncreakcó (PCR) vagy fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alkalmazásával történik. Monogénes (egy génhez kapcsolódó) betegségek esetében PCR, míg számbeli- és szerkezeti kromoszóma rendellenességek esetében általában FISH a választott eljárás. Létezik egy harmadik módszer is, az úgynevezett CGH (comparative genomic hybridisation, azaz összehasonlító genomiális hibridizáció). Ennek alkalmazásával a sejtek teljes genetikai állománya vizsgálható, így a módszerrel nemcsak ismert genetikai rendellenességek szűrhetők ki nagy biztonsággal. Ez az eljárás azonban jelenleg még rendkívül drága, ezért rutinszerűen nem alkalmazzák.
Polimeráz láncreakció (PCR)
A PCR egy molekuláris biológiai technológia DNS enzimatikus amplifikálására (azaz a kópiák megsokszorozására) élő szervezet, például E. coli vagy élesztő, igénybevétele nélkül. A technológia lehetővé teszi a DNS egy kis darabjának megsokszorozását analízis céljából. A PCR általánosan használt módszer az élettudományi kutatásokban és egészségügyi laboratóriumokban a legkülönfélébb feladatokra: például örökletes betegségek kimutatása, genetikai ujjlenyomat azonosítása, fertőző betegségek diagnosztikája, gének klónozása és apasági vizsgálatok.
A PGD-nél alkalmazott egysejtes PCR teszteket most már több mint 30 különböző monogénes betegség (például cisztikus fibrózis vagy gerincvelői izomsorvadás) kimutatására lehet alkalmazni. A PGD első klinikai alkalmazása során, 1990-ben az Y-kromoszóma specifikus szakaszainak amplifikálására használták a PCR-t, hogy egy nemhez kapcsolódó öröklődő betegség kimutatásához megállapítsák az embrió nemét.
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)
A FISH módszer fluoreszcens festékkel jelzett specifikus nukleinsavpróbáknak a vizsgálandó DNS-mintákkal való hibridizációján alapul. Ezek a fluoreszcens próbák kapcsolódnak a helyben rögzített intakt sejtek cél-DNS szekvenciájához. A fluoreszcens jelzés epifluoreszcens mikroszkóppal, áramlásos citométerrel, vagy lézer szkennerrel mutatható ki.
A FISH eljárást egyre gyakrabban használják PCR helyett az embrió nemének meghatározására, mert a PCR viszonylag sok téves eredményt ad a FISH-hez képest. A módszert ezenkívül fel lehet használni a rendellenes kromoszómaszám (amilyen például a 13-as, 18-as, 23-as kromoszóma triszómiája vagy az X-kromoszóma monoszómiája), valamint más kromoszóma-eltérések kimutatására.
Fagyasztás és vitrifikáció
Ötödik napon, hólyagcsíra állapotban végzett mintavétel esetén a vizsgálati eredmény nem készül el a mintavétel napján. Az egészséges preembriókat csak egy későbbi ciklusban lehet visszaültetni, azokat alacsony hőmérsékleten, cseppfolyós nitrogénben vagy annak gőzében tárolni kell. A hagyományos mélyfagyasztási módszereket egyre inkább kiszorítja egy új eljárás, az ún. vitrifikáció. Ennek lényege, hogy megfelelő védőanyagok (ún. krioprotektánsok) hozzáadásával és nagyon gyors hűtéssel kizárják a jégkristályok képződését. Az oldat ilyenkor üvegszerű szerkezetet vesz fel. Ezzel a módszerrel a preembriók felmelegítés utáni túlélése lényegesen jobb, mint hagyományos mélyfagyasztással.
